1. Tujuan
Mengetahui apakah suatu sediaan mengandung pirogen
atau tidak
2. Prinsip kerja
Menyuntikkan secara intravena ketubuh kelinci
di bawah kondisi
tertentu dan selanjutnya
dipantau dan dicatat temperatur 3 kelinci dalam jangka
waktu tertentu.
3. Teori Percobaan
Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan
demam dansering mencemari sediaan farmasi. Sampai saat ini, substansi pirogenik
yangdiketahui paling aktif
dan paling sering
mencemari sediaan farmasi
adalah endoktoksin; selain itu masih banyak substansi pirogenik lainnya
seperti bakteri,fungi , DNA–RNA virus dan lain-lain (Suwandi, 1988).
Endotoksin
merupakan suatu produk
mikroorganisme terutama daribakteri gram negatif yang terdiri atas
suatu senyawa kompleks lipopolysaccharidayang
pyrogenic, suatu protein
dan suatu lipid
yang innert. Pada
saat iniendoktoksin diketahui
merupakan pirogen yang paling, kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam suatu
sediaan perlu diperhitungkan; karena manusia tidakhanya respon terhadap
endoktoksin saja tetapi juga pirogen yang lain.
Pada tahun 1923 Seibert membuktikan bahwa pirogen
adalah substansiyang tidak tersaring, thermostabil, dan non – volatile. Pada
tahun 1937 Co Tuimembuktikan bahwa kontaminasi pirogen ini juga terjadi pada
alat-alat seperti wadah-wadah untuk melarutkan obat suntik, juga pada zat kimia
yang digunakansebagai zat berkhasiat. Pirogen dapat bersumber dari:
a. Pelarut
b. Zat
aktif
c. Peralatan
d. Timbul
pada proses penyimpanan
Sifat – sifat pirogen:
a. Thermostabil, sehingga
hanya dapat dihilangkan
dengan pemanasan padasuhu 650ºC selama 1 menit, 250ºC selama
15 menit atau 180ºC selama 4 jam.
b. Larut
dalam air. Sehingga tidak bisa memakai penyaring bakteri.
c. Tidak
dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa.
d. Tidak
menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan air.
e. Berat
molekul (BM) antara 15.000 – 4.000.000⁻ Ukuran umumnya 1 – 50µm.
Secara garis besar, pirogen dikelompokkan menjadi 2
golongan; yaitupirogen endogen dan pirogen eksogen:
a. Pirogen Endogen,
yaitu faktor-faktor yang
berasal dari dalam
tubuh kitasendiri sebagai reaksi
kekebalan melawan kuman penyakit yang masuk ketubuh. Misalnya interleukin-1
(IL-1), interleukin-6 (IL-6), alpha-interferon,dan tumor necrosis factor (TNF).
b. Pirogen
Eksogen, yaitu faktor eksternal tubuh yang menyebabkan gangguanpada fungsi tubuh
manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan virus. Selainitu, bisa juga
berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan oleh bakteri atau virus tertentu.
Jika suatu pirogen masuk ke tubuh, maka pirogen
menjadi suatu bendaasing yang dapat
menimbulkan respon imun berupa demam. Demam yaitu suatu keadaan ketika
temperatur tubuh di atas batas normal yang dapat disebabkan olehkelainan dalam
otak sendiri atau oleh bahan – bahan toksik yang mempengaruhi pusat pengaturan
temperatur. Penyebab – penyebab tersebut meliputi penyakit bakteri, tumor
otak, dan keadaan
lingkungan yang dapat
berakhir denganserangan panas.
Uji pirogenitas adalah uji yang dilakukan untuk
mengetahui apakan suatusediaan uji bebas pirogen atau tidak
(Anonim, 1995) dengan
maksud untukmembatasi resiko reaksi
demam yang dapat diterima oleh pasien apabila diinjeksidengan suatu
sediaan farmasi (Suwandi,
1988). Uji pirogenitas
biasanyamenggunakan kelinci. Pengujian ini ditetapkan di USP pertama
kali pada tahun1942 dan merupakan pengujian resmi untuk menentukan
non-pirogenitas sediaanfarmasi. Sejak diketahui bahwa endotoksin ternyata mampu
menggumpalkan seldarah Limulus, kemudian
dikembangkan suatu pengujian
untuk mendeteksiadanya
endotoksin dengan menggunakan reagensia yang dibuat dari sel darahLimulus.
Pengujian ini kemudian dikenal sebagai metode
Limulus AmebocytLysate (LAL Test). Meskipun demikian,
pengujian pirogenitas menggunakan
kelinci masihmenjadi pilihan
utama karena:
a. Metode
ini telah lama dikenal dan digunakan untuk menguji berbagai sediaandan terbukti
memberikan hasil memuaskan.
b. Kelinci
memiliki sensitivitas terhadap substansi pirogenik yang mirip
denganmanusia. Kenaikan suhu
kelinci akibat substansi-pirogenik, sampai
batastertentu masih dapat diterima oleh manusia; sehingga kenaikan suhu
kelincitersebut dapat distandardisasi terhadap
substansi pirogenik yang
dapat diterima manusia. Bangham
menyebutkan, uji kelinci
menggambarkanseluruh respon farmakologis terhadap pirogen dan relevan
dengan respon padamanusia.
c. Metode kelinci
mampu mendeteksi semua
pirogen termasuk endoktoksinsedangkan LAL tidak.
Sedangkan
kelemahan metode uji
pirogenitas menggunakan kelincidibandingkan dengan LAL Test antara lain:
a. Memerlukan pemeliharaan
dan perawatan hewan dan
laboratorium yanglebih intensif.
Hewan harus dipelihara dalam ruangan dengan temperaturtidak jauh berbeda dengan
tempat percobaan. Pemeliharaan hewan harusdilakukan dengan sebaik mungkin untuk
menghindari infeksi penyakit yangdapat mengganggu percobaan atau mengacaukan
interpretasi hasil. Beratbadan kelinci harus dijaga jangan sampai mengalami
penurunan yang berarti dalam 1 minggu menjelang digunakan.
b. Sensitivitas
dipengaruhi oleh musim, kegaduhan, kegelisahan, makanan danlain sebagainya.
Kegelisahan akan dapat menyebabkan kenaikan suhu relatiptinggi, sehingga mengacaukan
interpretasi hasil.
c. Variabilitas
biologis. Respon setiap kelinci terhadap substansi yang samabelum tentu sama,
sehingga terdapat variasi kenaikan suhu pada tiap kelinci.
1. Alat dan bahan
Hewan percobaan :
Kelinci
Bahan :
NaCl steril bebas pirogen
NaCl dari sediaan yang dibuat mahasiswa
Alat :
alat suntik steril 10 ml
Kotak kelinci
Timbangan
Thermometer
2. Prosedur kerja
Kelinci
dikelompokkan menjadi 3 kelompok (Kelompok Kontrol Negatif. Kelompok uij 1 dan
kelompok uji 2)
Note
:
1. Waktu
penyuntikan tidak lebih dari 4 menit dan dosis yang diberikam 5mL
2. Suhu
maksimun adalah suhu tertinggi yang dicatat seama 1jam setelah penyuntikkan
3. Kelinci
dinyatakan memenuhi syarat jika perubahan suhu awal kelinci melebihi 1⁰C antar
kelincinya
4. Kelinci
dinyatakan tidak memenuhi syarat jika perubahan suhu awal kelinci lebih besar
0,2⁰C, suhu awal lebih kecil dari 38⁰C dan lebih besar dari 39,8⁰C
1. Perhitungan dosis
No
|
Berat badan
|
Kelompok Percobaan
|
Dosis
|
1
|
1,3 Kg
|
Kelompok Kontrol
|
1,3 / 1,2 x 5mL = 5,41mL |
2
|
1,2 Kg
|
Kelompok uji 1
|
1,2 / 1,2 x 5mL = 5mL
|
3
|
1,4 Kg
|
Kelompok uji 2
|
1,4 / 1,2 x 5mL = 5,83mL
|
2. Perbandingan Suhu Tubuh
No
Kelinci
|
Control
|
Suhu
ke 1
|
Suhu
ke 2
|
Suhu
ke 3
|
Suhu
rata – rata
|
Kenaikan
suhu
|
1
|
37,35
|
38,00
|
38,00
|
38,00
|
38,00
|
0,47
|
2
|
38,10
|
38,50
|
38,60
|
38,60
|
38,57
|
0,47
|
3
|
37,80
|
38,00
|
38,00
|
38,10
|
38,03
|
0,23
|
Rata rata
|
1,17
|
|||||
3. Grafik
Pada percobaan ini, uji
pirogenitas dilakukan dengan metode Rabbit Test. Uji kelinci telah lama
digunakan dengan baik untuk membantu industri farmasi mengujipirogenitas
sediaannya. Farmakope Indonesia edisi
III menyebutkan, suatu sediaan dinyatakan memenuhi syarat jika kenaikan suhu
ketigakelinci tidak melebihi batas tertentu dan tidak memenuhi syarat jika
total kenaikkan suhu ketiga kelinci melebihi batas tertentu.
Tahap awal yang dilakukan adalah mengukur suhu
badan kelinci dengan interval waktu 15
menit selama 30 menit sebelum penyuntikan untuk mengetahui suhu awal.
Selanjutnya hewan uji disuntik dengan sediaan uji yang sebelumnya telah
dihangatkan kurang lebih 38,5° C ke dalam vena auricularis tiap kelinci dan
dilakukan evaluasi. Penghangatan sediaan uji bertujuan agar sediaan tersebut
tidak terkontaminasi. Dan penyuntikan dilakukan pada vena auricularis karena
pada vena tersebut pembuluh darah kelinci dapat terlihat dengan jelas.
Penyuntikan tidak boleh lebih dari 4 menit karena obat yang disuntikan dapat
terkontaminasi oleh bakteri lain. Mekanisme pengaruh pirogen pada timbulnya
demam.
Demam dapat timbul dari terpaparnya
tubuh manusia terhadap
pirogen eksogen yang
kemudian akan mengakibatkan terstimulasinya pirogen
endogen untuk melindungi
tubuh dan menciptakan kekebalan
melawan pirogen eksogen tersebut, atau disebabkan pengaruhpirogen endogen itu
sendiri. Efek anti demam iniyang menyebabkan terjadinya fluktuasi suhu tubuh
selama kondisi demam.
Termometer yang digunakan pada uji pirogenitas
ini memiliki ketelitian 0,1°C agar saat pengukuran suhu kelinci dapat diukur
dengan tingkat ketelitian yang tinggi sehingga perubahan suhu sekecil apapun
dapat terukur dengan tepat. Dari percobaan didapat hasil, kelinci pertama
memiliki suhu respon 0,47°C dengan suhu awal
37,35°C, kelinci kedua memiliki suhu respon 0,47°C dan suhu awal 38,10°C,
kelinci ketiga memiliki suhu respon 0,23°C dengan suhu awal 37,80°C. Suhu respon
penginjeksian dengan NaCl P steril didapat dari pengurangan antara suhu maksimal
dari pengukuran suhu tiap 15 menit sebanyak 3 kali dengan suhu awal. Pada
kelinci pertama suhu maksimalnya 38,0°C, kelinci kedua 38,6°C, dan kelinci ketiga 38,1°C. Jumlah suhu respon
dari ketiga kelinci tersebut adalah 1,17°C. Suhu respon yang didapat kemudian dilakukan analisis pada tabel
persyaratan sediaan uji.Berdasarkan
hasil tersebut, sediaan uji memenuhi syarat sediaan steril (lolos ujipirogenitas). Karena hasilnya tidak melebihi kolom 2 yaitu
untuk jumlah kelinci percobaan 3 kelinci tidak melebihi 1,2 °C, 1,17 °C kurang
dari atau tidak melebihi 1,2°C berarti sediaan uji Nacl (0,9%) memenuhi syarat
uji pirogenitas.
BAB V
PENUTUP
1. Kesimpulan
a) Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan
terhadap sediaan steril NaCl 0,9% didapatkan hasil jumlah
respon 1,17°C. 1,17°C kurang dari atau tidak melebihi 1,2 °C berarti sediaan
uji Nacl (0,9%) memenuhi syarat uji pirogenitas.
0 komentar:
Post a Comment